Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1
Шрифт:
МЕТОДЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА
При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro. С другой стороны, в некоторых случаях удается получить новые клеточные линии, синтезирующие большее
Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени, когда идут серийные эксперименты. Все это делает проблему сохранения генофонда весьма актуальной.
Можно, конечно, пассировать и перевивать клеточные культуры. Однако при этом возникает опасность сомаклональной изменчивости, накопления мутаций, контаминаций (заражения чужеродным генетическим материалом). Это также требует определенных финансовых и трудовых затрат (необходимость частых пересадок, расходы, связанные со средой и т. д.). Цель исследователей состоит в увеличении интервала между пересадками. Существует разные подходы к сохранению куль-
— криосохранение,
— замедление роста,
— сушка (распылительная и лиофильная) — для клеток микроорганизмов.
Криосохранение
Криосохранение — замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196 °C.
Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:
— вид и тип клеток,
— их концентрация в суспензии,
— состав среды для консервирования,
— вид и концентрация криопротектора,
— режим охлаждения и отогрева,
— способ реабилитации клеток после отогрева.
Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой.
Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1•105-5•106 клеток в 1 мл.
Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:
— 2–6 % маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей;
— аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5 %), аспарагин, ?-аминомасляную кислоту слоту;
— диметилсульфоксид (ДМСО), который добавляют к среде для предкультивирования в концентрации от 2,5 до 10 % на 48 часов для увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны;
— кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8 — +10 °C, а затем при +2 — +5 °C в течение 1–6 недель.
Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования.
Криопротекторы —
Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа (рис. 27):
Рис. 27. Замораживание клеток:
а) быстрое, б) медленное, поэтапное
1. От +20 до -28 °C со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35 °C), выдерживают при этой температуре 15 минут.
2. Погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до — 196 °C)
Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии — на спиртовой бане (0,5–1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32 °C (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32 °C). Далее переносят ампулы в жидкий азот.
При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 — +40 °C, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5–1 минуты.
После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3-10 % раствором сахарозы.
Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.
Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.
Замедление роста
Замедления роста можно добиться следующими методами:
1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).
2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.