Мозг. Такой ли он особенный?
Шрифт:
Роберто Лент, заведующий отделом анатомии и один из руководителей, взявших меня на работу, определенно располагал лабораторией – и, по иронии судьбы, он в это время заканчивал работу над учебником, называвшимся по-английски «Сто миллиардов нейронов». Когда я спросила его, откуда он взял это число, Роберто, как я и ожидала, не смог ответить. «Как бы вы отреагировали, если бы я сказала вам, что знаю, как правильно посчитать клетки?» Роберто отреагировал великолепно. Он не только выслушал мою странную идею, но и дал мне место в своей лаборатории, разрешив пользоваться оборудованием и расходными материалами, несмотря даже на то, что, если моя идея оказалась бы верной, ему пришлось бы менять название руководства (что он позже и сделал), и это получилось у него очень легко. Правда, первое издание уже с успехом разошлось в Бразилии к тому времени, когда был получен результат, но в следующих изданиях к заглавию был просто добавлен вопросительный знак: «Сто миллиардов нейронов?».
На полке в лаборатории валялся забытый кем-то кухонный блендер, а человеческие мозги можно было без труда взять в отделении патологической анатомии в соседнем университетском корпусе.
Вначале мне все же пришлось использовать маленький блендер. Выделение клеточных ядер – это стандартная биохимическая процедура, и я воспользовалась протоколом, который предусматривал глубокое замораживание крысиных мозгов в жидком азоте, для того, чтобы расщепить клеточные мембраны, а затем твердые куски ткани я помещала в ручной блендер. Результат было легко предвидеть: кусочки замороженного крысиного мозга разлетались по всей лаборатории. Превращение же мозга в суп и подсчет всех клеток будут возможны только в том случае, если мне удастся не потерять ни единого ядра. Потери кусочков замороженного мозга, пусть даже они прилипали к крышке блендера, были абсолютно неприемлемы.
Измельчение слегка зафиксированной ткани в ручном стеклянном гомогенизаторе (рис. 2.1) было намного более перспективным. Фиксация в формальдегиде сшивает молекулы белков в тканях, делает их жесткими и прочными. Поскольку ядерная мембрана содержит много белка, она очень хорошо фиксируется формальдегидом и приобретает устойчивость к мощным физическим воздействиям. Первые попытки со свежими, незафиксированными тканями показали мне, что представляют собой разрушенные ядра: они превращались в хлопья свободной ДНК, которая под микроскопом выглядит окрашенной в синий цвет, так как для окраски ядер я применяла краситель DAPI. Препараты из фиксированных в течение всего нескольких часов тканей сохраняли большую долю интактных ядер, но все же многие из них разрушались.
Рис. 2.1. Стеклянный гомогенизатор тканей выглядит как стеклянные цилиндрические ступка и пестик. В таком устройстве гомогенизируют (размалывают до гомогенного состояния) ткань головного мозга
Я нашла решение после того, как начала фиксировать ткани в течение двух недель. Эта идея спасла всю работу: если даже короткая фиксация сохраняла какое-то количество ядер целыми, предохраняя их от разрушения в гомогенизаторе, то тщательная, длительная фиксация делала ткани плотными, как камень, и можно было надеяться, что все до единого ядра оставались целыми в процессе обработки, а это и было целью всего предприятия. Наконец все сработало: когда в каждом опыте я стала получать приблизительно одинаковое число ядер, я поняла, что у меня получился новый, весьма эффективный метод подсчета клеток.
После некоторого обдумывания таких деталей, как сбор ядер и перенос в градуированные пробирки без ощутимых потерь, у меня в руках был стабильный протокол опытов. Он состоял из рассечения твердого, фиксированного мозга на более мелкие, анатомически и функционально значимые области, например на кору целиком, мозжечок, обонятельные луковицы и «остальное» (пока). После взвешивания каждая часть рассекалась на тонкие срезы, затем на мелкие кубики, что облегчало процесс растирания: оно производилось в среде детергента Тритон-Х100 между стеклянными стенками гомогенизатора, что позволяло разрушать клеточные мембраны, но сохранять мембраны ядерные. Двадцать минут вращательно поступательных движений поршнем в цилиндре – и я получала мутную, но без хлопьев жидкость, содержащую взвесь ядер. Мозг был окончательно превращен в суп. Следующий шаг заключался в тщательном сборе ядер – не должно было пропасть ни одно ядро, подлежащее учету. Для этого я несколько раз промывала поршень в цилиндре, потом отсасывала пипеткой ядерный осадок на дне цилиндра, затем снова промывала поршень, снова отсасывала жидкость и так несколько раз, до тех пор пока не получала определенный объем, содержащий все ядра. К этой жидкости я добавляла краситель для окрашивания ДНК, а затем физиологический раствор до объема, который можно было легко определить в градуированном цилиндре. Окрашивание остатка последней промывной жидкости после окрашивания DAPI позволяло убедиться в том, что в гомогенизаторе не осталось больше ядер. Все ядра всех клеток ткани – окрашенные и собранные – находились теперь в известном объеме, готовые к подсчету. Теперь оставалось только встряхнуть суспензию, чтобы равномерно распределить ядра по объему, а потом выбрать несколько аликвот для подсчета и экстраполировать результат на весь объем.
Подсчет свободных клеточных ядер методом флуоресцентной микроскопии не требует специальной
Имея на руках число клеток, я воспользовалась тем преимуществом, что существуют антитела, которые специфически связываются с белком, который экспрессируется исключительно в клеточных ядрах нейронов и только в них. Этот белок называют нейрональным ядерным белком (neuronal nuclear protein – NeuN). Он был открыт в 1992 году [53] , когда его функция была еще неизвестна [54] . У NeuN есть одно важное свойство, которое позволило мне надежно считать экспрессию NeuN маркером всех нейронов, и только нейронов, – присутствие NeuN можно выявить связыванием его специфическими антителами, окрашенными красным красителем и добавленными в суспензию. Это потребовало реакции небольшого количества суспензии с меченными красным красителем анти-NeuN-антителами, и спустя несколько часов я уже могла снова поместить ядра под микроскоп для того, чтобы определить, какой процент всех ядер (окрашенных ранее в синий цвет) принадлежал нейронам (которые теперь были окрашены в красный цвет). Подсчета 500 ядер (что заняло ровно пятнадцать минут) хватило для определения процента нейронов с точностью до 0,2 %. Приложив это процентное отношение нейронов к общему числу клеток в выбранных структурах, я получила общее число нейронов в них. Вычтя это число из общего количества клеток, я получила число всех остальных клеток в ткани (вероятно, это было число глиальных клеток). Сложив результаты, полученные для каждой структуры – а я начала с простого разделения целого мозга на мозговую кору, мозжечок и все остальное, – я впервые в истории получила прямую оценку общего числа нейронов и других клеток в целом мозге крысы. Вся процедура была выполнена меньше чем за один рабочий день.
53
Mullen, Buck, and Smith, 1992.
54
Позднее было показано, что этот белок связывает специфические последовательности РНК и регулирует сплайсинг мРНК (матричной РНК) в клеточном ядре. Теперь его называют еще Fox-3, после того как благодаря причудливой случайности было обнаружено, что он является гомологом гена Fox (Feminizing locus On X – феминизирующее действие на Х), который участвует в детерминировании пола у нематод (Caenorhabditis elegans). Поскольку трудно ожидать, что фактор, определяющий пол, может быть непосредственно вовлечен в функции нейронов, постольку это, вероятно, можно считать одним из многих примеров генов, которые выполняют разные функции на разных стадиях развития или на разных этапах эволюции.
Я была страшно взволнована. Я теперь знала то, чего в этот момент не знал ни один человек в мире: сколько клеток содержится в целом мозге крысы.
Возник, правда, еще один вопрос: насколько достоверны эти данные, а достоверность в нейроанатомии означает сравнение полученных данных с данными, полученными стереологическим методом. Сравнение было невозможно для тех областей мозга, которые недоступны стереологическому исследованию; в конце концов главной целью создания нового метода и была возможность исследовать те области, где была неприменима стереология. К счастью для нас, в литературе нашлось несколько работ со стереологическими оценками количества нейронов в коре и мозжечке крысиного мозга. Наши результаты были сопоставимы с данными этих работ.
В 2004 году Карл Херруп, работавший в то время в Кливлендском университете, приехал на организованный Роберто и мною в Кашамбу (Бразилия) симпозиум, посвященный важности проблемы определения числа клеток в головном мозге. Карл давно интересовался подсчетом клеток в мозжечке – это его любимый отдел мозга, – но оставил эту идею в связи с отсутствием адекватного метода (мозжечок является плохим объектом стереологического метода из-за высокой плотности расположения крошечных нейронов в зернистом слое, которые расположены настолько тесно, что сливаются при рассматривании их под микроскопом). Карл был научным руководителем одной моей близкой подруги, и благодаря этому я когда-то смогла получить место в его лаборатории и всегда считала его моим неофициальным наставником. Когда в Кашамбу я объяснила Карлу суть моего метода подсчета мозговых клеток, он улыбнулся: «Я думал о чем-то подобном несколько лет назад. Я хотел использовать цитометрию в потоке для подсчета клеток, выделенных из ткани. Но серьезно этой проблемой я так и не занялся. Вы меня опередили, и я рад, что у вас это получилось!» Узнав, что статья о работе уже готова, но не опубликована, Карл сразу же вызвался стать ее редактором в Journal of Neuroscience. А в 2005 году после тщательного обсуждения статьи коллегами Роберто и я получили оттиск статьи, напечатанной в одном из самых авторитетных журналов в этой области биологии [55] .
55
Herculano-Houzel and Lent, 2005.