Гены и развитие организма

Нейфах Александр Александрович

В этой главе мы старались показать, как различные способы гибридизации создают комбинации двух генотипов и цитоплазмы или комбинации клеток с разными генотипами. Возможности, которые открывают эти методические подходы, еще не исчерпаны, и работа в этих направлениях (особенно с соматическими гибридами и с химерами) активно продолжается. Гибридизация животных и растений уже привела к огромным практическим достижениям в получении новых пород и сортов. Можно ожидать, что и методы «клеточной инженерии» дадут не только важные теоретические, но и чисто практические результаты.

Слияние

ранних зародышей приводит к появлению аллофенных мышей (химер)

Эмбрионы мышей разных линий (например, с черной и белой окраской) на стадии восьми клеток извлекают из материнских организмов, освобождают от оболочек и сближают. При этом образуется один зародыш смешанного происхождения. Его пересаживают в третью мышь — «мать-воспитательницу», которая и рождает химерных мышат

Глава VIII

Манипуляции с молекулами

В предыдущих главах мы неоднократно говорили о роли ДНК, о функции генов, о синтезе РНК как о первом этапе реализации генетической информации. Почти во всех случаях об этих молекулярных процессах судят, не видя самих молекул, фактически не дотрагиваясь до них. В лучшем случае синтез РНК или белка определяют по скорости включения в эти вещества их радиоактивных предшественников — нуклеотидов или аминокислот. В этой главе речь пойдет об опытах, Которые проводят почти исключительно в пробирках с чистыми препаратами ДНК и РНК, выделенными из клеток. Если исследование скорости синтеза макромолекул фактически заканчивается их выделением, то в работах, которые мы здесь обсудим, исследования с этого только начинаются.

При нагревании ДНК выше 80–90° водородные связи, соединяющие комплементарные пары нуклеотидов друг с другом, разрываются и двойная спираль ДНК распадается на две одиночные нити. Это называется денатурацией ДНК. Если теперь несколько понизить температуру раствора и поддерживать ее такой достаточное время (это называется отжиг), то водородные связи между отдельными комплементарными основаниями (А и Т, Г и Ц) будут возникать снова. Однако устойчивая двойная спираль ДНК образуется лишь в том случае, если эти связи восстановятся на достаточно большом протяжении молекулы, т. е. если случайно встретятся две одиночные нити, комплементарные друг другу. Это называется ренатурацией ДНК.

Ренатурация происходит с тем большей скоростью, чем выше в растворе концентрация комплементарных друг другу отрезков ДНК. Поэтому если ренатурация происходит быстро, то данная последовательность ДНК представлена в геноме большим числом копий. И наоборот, если какая-то последовательность нуклеотидов редка и составляет лишь небольшую долю всей ДНК, то и случайная встреча двух таких комплементарных нитей происходит редко, а ренатурация такой уникальной ДНК будет идти очень медленно. Так, по скорости ренатурации можно судить о том, как часто представлены в геноме те или иные гены.

Одиночная нить ДНК может связываться водородными связями и с комплементарной ей нитью РНК, образуя гибридную ДНК-РНКовую молекулу. Естественно, что комплементарными ДНК могут быть только те РНК, которые ранее были транскрибированы с нее или с точно такой же ДНК. Это позволяет исследовать, какая часть ДНК участвует в синтезе РНК и, наоборот, какие виды РНК присутствуют в клетке на разных стадиях развития или в разных тканях организма.

Манипуляции с молекулами нуклеиновых кислот стали особенно разнообразными и эффективными после того, как появились методы генной инженерии. С их помощью удалось обнаружить в эмбриональных клетках слабую активность многих тысяч генов, которые до того считались «молчащими»,

а также подсчитать количество копий различных мРНК, и в том числе мРНК для некоторых отдельных белков. Эти данные заставляют сейчас по-новому пересмотреть многие, казалось бы уже устоявшиеся, представления.

1. Ренатурация ДНК с ДНК

Для исследования ренатурации ДНК ее предварительно разрезают на небольшие куски, но 300–600 пар нуклеотидов, денатурируют нагреванием, а затем подвергают длительному отжигу при температуре 70–80°, при которой случайные короткие комплементарные последовательности распадаются, а ренатурируют лишь большие комплементарные участки ДНК, фактически те самые, которые оказались разделенными при денатурации.

Ренатурация ДНК вирусов происходит очень быстро. Так как скорость ренатурации зависит от концентрации ДНК (C₀), то точнее говорить, что для вирусной ДНК низко произведение концентрации на время ренатурации (C₀t). Это и понятно, так как количество генов в геноме вирусов мало (порядка сотни) и вероятность одиночной нити ДНК «найти» «свою» вторую половину достаточно велика. Ренатурация ДНК бактерий происходит значительно дольше — число различных генов и, следовательно, число различных последовательностей ДНК в этом случае выше в десятки раз.

Казалось, можно было предсказать, что ренатурация ДНК животных должна идти еще намного медленнее (величина C₀t должна быть выше). Однако фактически это не совсем так. Определенная часть ДНК (около 10 %) ренатурирует очень быстро, как у вирусов или еще быстрее. Еще некоторая, иногда значительная часть ДНК ренатурирует тоже довольно быстро, хотя и медленнее, чем у вирусов и бактерий. И лишь остальные 50–70 % ДНК (иногда меньше) ренатурируют так медленно, как это и ожидалось (C₀t в 10³ раз выше, чем для ДНК бактерий).

Объяснение этому факту — в том, что часть ДНК в геноме животных и растений состоит из повторяющихся последовательностей ДНК. Действительно, если какие-либо гены повторяются сотни или тысячи раз, то их концентрация в растворе соответственно возрастает и скорость их ренатурации будет выше, чем для генов, которые уникальны, т. е. представлены в геноме только один раз. He все повторяющиеся последовательности являются настоящими генами, т. е. несут информацию о структуре белка. Так, особенно высоко повторяющиеся последовательности (10⁴—10⁵ раз на геном) состоят из одинаковых коротких, идущих друг за другом (тандемных) участков и находятся на концах хромосом и в тех точках, к которым прикрепляются нити веретена при митозе. Очевидно, что эти ДНК служат не для кодирования белков, а выполняют в хромосоме какую-то механическую роль.

Среди умеренных повторов (10²– 10³ раз) роль некоторых известна; Это прежде всего те участки ДНК, которые кодируют РНК для белоксинтезирующей машины. Хотяэти участки ДНК и не кодируют белки, но их тоже часто называют генами. Так, гены больших рРНК (18S и 28S) повторяются от нескольких десятков раз у насекомых до тысяч раз у отдельных рыб и амфибий.

Еще чаще повторяются гены для маленького компонента рибосомной РНК — 5S РНК: у ксенопуса их 24 000, а у человека 2000. Наконец, гены для транспортных РНК(их более 40 видов) также повторяются сотни и тысячи раз, но для разных видов тРНК число этих повторов различно.