Гены и развитие организма
Шрифт:
Решающую роль в генной инженерии играет особый вирусный фермент, который называется «обратная транскриптаза». С его помощью осуществляется синтез ДНКна РНК. Это позволяет как бы синтезировать гены, точнее, получать точную ДНКовую копию всех или одного вида РНК. Этот «ген» не будет настоящим уже потому, чтов нем не будет копий интронных участков, которые не попадают в состав мРНК.
Наконец, существует возможность «встроить» готовую ДНК — синтезированный ген (копию мРНК) — в особую кольцевую ДНК-плазмиду, способную автономно размножаться в бактериальных клетках. Это позволяет получить нужный нам вид ДНК практически в неограниченном количестве.
Размножение бактерий, содержащих введенную Плазмиду, позволяет получить «библиотеку» генов. Если ДНК, выделенную из клеток, разрезать на части, встроить в плазмиду, ввести в бактерии и
В принципе в такой «библиотеке» содержатся все гены, отделенные друг от друга и многократно размноженные, т. е. клонированные. Однако найти в такой «библиотеке» нужный ген не так просто, Для этого используют такие клетки животных, где этот ген активно работает. Для генов глобина это будущие эритроциты — эритробласты, длягена овальбумина это клетки яйцевода кур. Из таких клеток получают мРНК, а из них пытаются выделить в чистомвиде один вид мРНК, например глобиновую. Имея такую мРНК, можно путем гибридизации проверить все клоныДНК и, если удастся, найти тот, в котором окажется нужный нам ген. Далее уже клон бактерий, содержащий этотген, будет постоянным его источником.
Используя эти сложные и трудоемкие методы, мы получили такие данные, которые вполне оправдали все усилия. Были, например, изучены гены глобина, овальбумина и десятки других и установлено их сложное строение с чередованием экзонов, кодирующих часть полипептидной цепи, и интропов, не несущих информации о белке. Очень немногие гены не содержали интронов, часто их было от двух до семи, но иногда попадались гены, расколотые на десятки экзонов, отделенных друг от друга нитронами. Смысл этого пока непонятен.
Часть генов была секвенирована, т. е. в них была определена последовательность нуклеотидов как в самом гене, так и в непосредственной близости от него. Наконец, некоторые гены (5SРНК и гены гистонов) были подвергнуты «хирургическим операциям»: от них отрезали кусочки различной длины и после этого проверяли, сохранил ли такой ген способность к быстрой и правильной транскрипции. Это позволило выявить вблизи гена или в нем самом регуляторные участки.
Имея клонированные и идентифицированные гены, можно исследовать не только их строение, но и функцию в клетке. Так, их можно, например, гибридизировать с политенными хромосомами дрозофилы и установить локализацию отдельных генов. Их можно гибридизировать с РНК из различных клеток или из разных стадий развития. Такой метод очень чувствителен и позволяет обнаружить такие РНК, которые содержатся в количестве одной-двух молекул на клетку. С помощью этих методов можно оцепить, сколько видов РНК синтезируется в клетке и в каком количестве копий представлены эти виды. Можно также выявить, сколько копий, в какой ткани и на какой стадии развития содержит клетка отдельных конкретных (индивидуальных) мРНК. Работа во всех этих направлениях ведется сейчас в десятках лабораторий мира, но возможности таких исследований еще далеко не исчерпаны.
4. Число активных генов и число копий мРНК
Методы генной инженерии, примененные к эмбриологическим объектам, показали, что в их клетках активно значительно больше генов, чем это считали раньше. Так, в ооцитах морских ежей активно около 40 тыс. генов, на бластуле и гаструле — не менее 20 тыс. и т. д. Только в дифференцированных тканях взрослого организма эти числа снижаются до 2–3 тыс. Такое же большое число активных генов было найдено и в других типах клеток: в культуре тканей млекопитающих — 20–40 тыс. генов, в культуре клеток дрозофилы — более 5 тыс., т. е. почти все ее гены.
Создается
Итак, наряду с относительно небольшим числом активно работающих генов в эмбриональных и дифференцированных клетках большое число генов (может быть, все?) функционируют очень слабо, так что нельзя определить, синтезируется ли тот белок, который мог бы ими кодироваться. О возможной функции этих слабоактивных генов можно сделать несколько предположений, впрочем не исключающих друг друга. Может быть, некоторые виды ферментов или белковых структур в клетке нужны в таких небольших количествах, что для их синтеза достаточно и нескольких молекул мРНК. Таковыми, например, должны быть белки центриоли, которых в клетке всего одна или две. Может быть, это регуляторные белки, действующие на отдельные гены, и тогда их содержание в клетке или на хромосомах тоже измеряется десятками молекул. Например, у кишечной палочки нормальная концентрация одного из регуляторных белков всего 10 молекул на клетку. И наконец, можно предположить, что слабая функция генов не имеет никакого значения, а отражает некоторое несовершенство регуляторного аппарата, запирающего гены. Что-то вроде неплотно прикрытых «подтекающих» кранов. Здесь опять напрашивается сравнение с хорошо изученными бактериями. У них ген в активном состоянии транскрибирует РНК в 1000 или даже в 10 000 раз быстрее, чем в неактивном, но это же означает, что и на неактивном гене происходит транскрипция одиночных молекул мРНК. Вместе с тем выше уже говорилось, что на разных стадиях развития животных количество слабо работающих генов различается. Оно уменьшается по ходу развития от 20–40 до 10–15 тыс., а в дифференцированных тканях падает до 2–3 тыс.
Метод гибридизации с ДНК отдельных генов позволяет оценить, как в ходе дифференцировки происходит накопление мРНК. Так, в клетках яйцевода молодых курочек содержится в среднем на клетку около одной молекулы мРНК овальбумина. После четырех ежедневных инъекций эстрадиола их становится 20 тыс., а через десять дней — 50 тыс. Если после этого инъекции прекратить, то количество молекул мРНК снова падает до пяти в одной клетке. Ho после однократной повторной инъекции гормона уже через 30 мин их становится 10, через час — 100, через три часа — 1000, а через сутки — 10 тыс. У взрослых кур мРНК синтезируются со скоростью около 30 молекул в минуту и половина их распадается приблизительно за сутки. При таком соотношении скоростей транскрипции и распада в каждой железистой клетке яйцевода курицы их накапливается более 100 тыс., что и обеспечивает интенсивный синтез овальбумина.
Этот пример показывает, что количество мРНК в клетке в равной мере зависит от скоростей их синтеза и распада и может регулироваться как той, так и другой величиной. Американский ученый Кафатос исследовал у бабочки павлиноглазки синтез особого фермента — коконазы, с помощью которого молодая бабочка растворяет стенку кокона и выходит из него. Оказалось, что мРНК коконазы в специальной железе вылупления образуется (транскрибируется) не быстрее многих других видов мРНК. Однако у большинства мРНК в клетках железы время жизни половины молекул 2,5 ч, в то время как для мРНК коконазы это время в 40 раз больше (100 ч). Только благодаря этому доля мРНК коконазы увеличивается от 8 % (от количества всей мРНК) в начале ее синтеза до 70 % через два-три дня. В результате клетки железы почти целиком заполняются ферментным белком, который в нужный момент обеспечивает выход бабочки.