Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №4
Шрифт:
Как самому выделить ДНК
1. Найдите что-то, что содержит много ДНК. Например, зелёный горошек (но можно куриную печенку, селёдочные молоки или лук).
2. Положите в миксер около 100 мл (полстакана) этого продукта, добавьте 1/8 чайной ложки соли и 200 мл (стакан) холодной воды. Взбивайте в течение 15 секунд. Миксер «сварит» вам горохово-клеточный суп.
3. Процедите смесь через ситечко или кусок капрона (чулок вполне подойдет). В полученную мякоть добавьте 1/6 от её количества (это будет примерно 2 столовые ложки) жидкого моющего средства (для посуды, например) и хорошо
4. Разлейте жидкость по пробиркам или другим стеклянным посудинам, чтобы в каждой было заполнено не больше трети объёма.
5. Добавьте в каждую пробирку по чуть-чуть либо сока, выжатого из ананаса, либо раствора для контактных линз и осторожно встряхните, переворачивая и наклоняя пробирку (если будете трясти слишком рьяно, разломаете ДНК и ничего не увидите).
6. Наклоните пробирку и медленно влейте в неё немного этилового спирта, чтобы он образовал слой поверх гороховой смеси. Лейте, пока спирта и смеси не окажется поровну. ДНК всплывёт наверх в виде хлопьев.
7. Деревянной палочкой (карандашом) выловите их и рассмотрите под микроскопом.
Конечно, для научных работников эта инструкция — в какой-то степени шутка и никто из них ДНК таким способом не выделяет, а между тем если и вправду воспользоваться ею, то всё получится! Выход ДНК будет, правда, невелик, а вещество — не особенно чистым, но увидеть в микроскоп длинные тонкие нити — кристаллы ДНК — вполне возможно.
Что же происходит с зелёным горошком или куриной печёнкой в процессе описанных манипуляций и почему, в конечном счете, ДНК оказывается отделённой от всех остальных веществ, которых в клетке великое множество?
1. Выбор объекта
ДНК, как известно, есть в каждой клетке, а значит, выделить её можно из любой ткани — даже из костей животных, чешуи рыб или древесины, где клеток не так уж много по сравнению с объёмом внеклеточного вещества.
Во всех тканях организма, как животного, так и растения, ДНК, как правило, одинакова. Отличаются эти ткани тем, что в одних из них помимо вещества наследственности больше почти ничего нет (молоки селёдки), а в других, таких, как костная ткань, содержание ДНК относительно невелико. Кроме того, существуют ткани, в клетках которых имеется удвоенный набор хромосом (к тетраплоидным относятся, в частности, клетки печени), а потому и ДНК в них в два раза больше, чем во всех остальных. В семенах растений относительное, содержание ДНК выше, чем в стебле, а из молодых растущих побегов её можно выделить существенно больше, чем из такого же по объёму куска одревесневшего ствола.
В общем, если перед исследователем не стоит какой-то специальной задачи, он старается выбрать для работы ткань, в которой мало межклеточного вещества и много самих клеток. Причём желательно, чтобы ткань легко распадалась на эти составляющие, а клетки не были перегружены белками (как мышечные), липидами (как жировые) или полисахаридами (как клетки мозга).
2. Дробим ткань на клетки
В миксере ткань, из которой мы собираемся добыть вещество наследственности, распадается на отдельные клетки: чтобы механически разорвать связи между ними требуется, как правило, гораздо меньше усилий, чем для того, чтобы повредить саму клетку. И поскольку при нашем способе выделения ДНК требуются более или менее целые, неповреждённые клетки, ясно, что консервированный горошек или солёная селёдка для такого эксперимента не годятся, — лучше уж взять что-нибудь свежезамороженное, если вы уверены, что продукт не размораживали в процессе хранения несколько раз.
А немного соли нужно добавить в раствор для того, чтобы клетки не полопались раньше времени: давление внутреннего содержимого на клеточную мембрану изнутри уравновешивают давлением соляного раствора снаружи.
3.
Что касается фильтрации, то она нужна для того, чтобы механически удалить из клеточной суспензии всевозможные примеси, в том числе, крупные куски ткани — всё равно те вещества, которыми мы собираемся обрабатывать смесь, не смогут проникнуть глубоко внутрь таких конгломератов, и для выделения ДНК они окажутся бесполезными.
А обработать полученные клетки следует, в первую очередь, каким-нибудь детергентом. Средство "Ферри", способное, согласно рекламе, легко отмыть самую жирную посуду, годится и для того, чтобы наделать больших дырок в липидной мембране, как самой клетки, так и её ядра. Если нет жидкого моющего средства, можно сделать концентрированный раствор стирального порошка — тоже подойдет.
В результате такой обработки всё клеточное содержимое вывалится наружу и окажется в растворе, который сделается при этом очень вязким, тягучим и существенно более прозрачным, чем была клеточная суспензия. Изменение консистенции раствора — верный знак того, что лизис прошёл успешно.
4. Тут всё ясно и без комментариев
Не наливайте слишком много раствора в ёмкость, туда предстоит ещё много чего налить, к тому же, если смеси будет в избытке, её будет трудно перемешать.
5. Освобождаемся от белков
Чего только нет в нашей смеси! Однако белков здесь — больше всего, причём именно они образуют самые прочные комплексы с ДНК. Существуют методики, когда белки удаляют из раствора, в несколько этапов. Например, часть из них легко денатурирует и выпадает в осадок при добавлении концентрированных растворов солей. В лабораторных условиях такие приёмы прекрасно работают, а от осадка исследователи освобождаются, помещая пробирки, на несколько минут, в центрифугу. После этого все более или менее крупные клеточные обломки, денатурированные белки и другие примеси оказываются на дне, образуя очень плотный осадок, и перелить в другую пробирку надосадочную жидкость, содержащую в основном нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК, — труда не составляет. Однако в домашних условиях этот этап очистки нам придётся пропустить, пожертвовав частью интересующего нас вещества, — оно так и останется „в белковом плену".
Мы сразу же перейдём к очистке ДНК от остаточных белков с помощью специальных ферментов, способных разрушать эти молекулы. Именно такие вещества содержит сок ананаса. Сами они — тоже белки, поэтому ананас, из которого выжимают сок, должен быть свежим: у ферментов нет ни малейшего шанса сохраниться неизменными в компоте или в консервированном продукте. Что же касается раствора для очистки линз, то если вы собираетесь использовать его — не забудьте положить таблетку для удаления белковых отложений! Сами по себе растворы для хранения контактных линз никаких активных веществ не содержат — иначе и нашим глазам не поздоровилось бы.
О том, что ферменты сработали, можно судить по уменьшению вязкости раствора. Если этого не происходит, поместите смесь в тёплое место (примерно 37 °C) на полчаса, иногда может потребоваться добавить больше ананасового сока или раствора для очистки линз.
6. Осаждаем ДНК из раствора
Теперь ДНК плавает в растворе сама по себе. Белки больше не цепляются за неё, хотя обломков всевозможных молекул в смеси по-прежнему много. В лабораторных условиях эти ненужные фрагменты убирают, тщательно перемешивая раствор с фенолом и/или хлороформом. Органические растворители, способные забирать белки „на себя", тяжелее воды, а потому при последующем расслоении смеси в центрифуге они опускаются на дно. После центрифугирования внизу пробирки оказываются фенол и/или хлороформ с растворёнными в них белками, а вверху — водная фаза, содержащая ДНК. Водную фазу собирают в отдельную пробирку и дальше работают уже с относительно чистым раствором.