Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №5

Журнал «Домашняя лаборатория»

Как было написано в какой-то газете "Многолетними усилиями ученых количество генов человека было сокращено со 100 тысяч до 25". Действительно, по последним оценкам в геноме человека около 25–30 тысяч генов. Оценка количества белков не изменилась — разных белков около 80-100 тысяч. Разнообразие белков обеспечивается альтернативным сплайсингом. Например, в одних клетках белок должен быть в цитоплазме, в других — такой же белок в мембране, в третьих — транспортироваться наружу. И это легко делается не за счет наличия разных генов для каждого случая, а за счет альтернативного сплайсинга, который цепляет на N-конец разные сигналы, при том что "рабочая часть" белка остается одной и той же, и одна изоформа белка размещается в мембране, другая изоформа белка — в цитоплазме, и т. д.

Сейчас общеизвестно, что не менее 50 % генов человека альтернативно сплайсируется.

Альтернативный

сплайсинг бывает разных типов (галочками показано, как вырезаются экзоны):

На этом рисунке показаны кассетный экзон (вставляемый в одни изоформы и отсутствующий в других), альтернативный акцептор, альтернативный донор, далее интрон может либо вырезаться, либо не вырезаться.

Теперь вернемся к вопросу о человеке и мыши. Человек и мышь биологически очень похожи. Белки похожи — уровень сходства аминокислотных последовательностей 80 %, также похожа значительная часть некодирующих областей генома. Практически у всех генов одинаково устроена экзон-интронная структура, для 99 % генов экзонная структура одинакова. Только 1 % генов уникален у каждого генома, остальные гены имеют гомологи в другом геноме. Интересен тот факт, что при таком относительно невысоком уровне различий человека от мыши внешне отличают легко. А два вида мухи дрозофилы вряд ли кто-то различит на глаз, хотя генетически они различаются сильнее, чем человек и мышь.

Возникает вопрос: Если геномы одинаковы, то может быть, и белки одинаковы? Непонятно, чем же человек отличается от мыши. Одинаково ли устроен альтернативный сплайсинг у мыши и человека?

Наивный подход для ответа на этот вопрос такой: возьмем весь набор альтернативного сплайсинга мыши и человека и сравним его. Этот подход неправильный, так как при исследовании альтернативного сплайсинга мы здесь имеем дело с EST. Если у человека EST просеквенировано несколько миллионов штук, то у мыши сделано всего несколько тысяч, поэтому там, где мы можем увидеть альтернативный сплайсинг у человека, можем ничего не увидеть у мыши, так как базы данных еще не совсем полные. Поэтому такое сравнение даст нам неправильный ответ.

Правильный подход в данной ситуации заключается в следующем: мы на основе имеющихся данных на человеческой ДНК строим мРНК, соответствующую белку, и затем этот белок проецируем на мышиный геном. Если оказывается, что для этого белка (или его части) нет кодирующих последовательностей в мышиной ДНК, то это значит, что тот экзон, который есть у человека, отсутствует в геноме у мыши.

Возьмем человеческие и мышиные гены, происходящие от общего предкового гена. Возьмем такие пары генов-ортологов, сделаем сравнение. Мы получим некоторую выборку, среди которым 50 % генов человека имеют такие изоформы, которых нет у мыши, то же самое и с мышью.

Сравним пары генов человек-мышь. Например, ген бета-глобина человека и мыши — такие гены, разошедшиеся в процессе эволюционного видообразования, называются ортологами. Выборку мы взяли не очень большую, в ней присутствовали гены, имеющие альтернативный спалйсинг. И оказалось, что у 52 % человеческих генов есть такие экзоны, которых нет у мыши. И половина мышиных генов имеет такие изоформы, которых нет у человека.

Но нам могут сказать — вы использовали EST, это неточные данные. Если мы возьмем полноразмерные мРНК (а данные по ним гораздо точнее, хотя общее количество сиквенсов по ним меньше), и проведем с ними ту же процедуру, то окажется, что примерно треть генов человека имеет изоформы, которые в геноме мыши не кодируются, отсутствуют, и также в геноме человека отсутствуют мышиные экзоны.

А

вот конкретные примеры: сверху изображены ДНК и ее изоформы у человека, а снизу — то же у мыши. Например, для белка р53, который участвует в регуляции клеточных процессов (раковое перерождение, апоптоз). Видно, что у мыши есть изоформа, которая теряет экзон, порождая стоп в другом месте.

Представленные данные показывают, что альтернативный сплайсинг — явление весьма распространенное, и что мышь сильно отличается от человека по альтернативному сплайсингу. Можно сделать и эволюционное предположение. По-видимому, альтернативный сплайсинг допускает большую свободу для создания новых белков, или изменения функций существующих белков, и в этом и состоит его связь с эволюцией.

Некоторые методы молекулярной биологии

Лекция № 26

Д.В. Ребриков

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

История

В начале 1970-х годов норвежскому ученому Хьеллю Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны (Наг Gobind Khorana) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров [1]. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом (Kary Mullis). Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию[2].

В начале использования метода после каждого цикла нагревания — охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. она была существенно улучшена. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий [3]. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'^5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Маллис работал в компании Цетус (Cetus), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании Хофман-Ла Рош (Hoffmann-La Roche) за 300 млн. долларов. Однако оказалось, что Taq-полимераза была охарактеризована русским биохимиком Алексеем Калединым в 1980 году [4], в связи с чем компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент [5]. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 г.