Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир

Партасарати Рагувир

Эта сложная схема действительно работает и благодаря приемлемой надежности стала первым коммерциализированным методом секвенирования нового поколения: в 2005 году его вывела на рынок компания 454 Life Sciences. Примерно за 500 тысяч долларов можно было купить прибор для пиросеквенирования, выдающий в виде длинной череды букв нуклеотидную последовательность загруженной в него ДНК⁶. При такой стоимости вы вряд ли украсили бы им свою гостиную, но исследовательским институтам среднего размера он был вполне по карману. (Для сравнения: в 2005 году дом в США можно было купить в среднем за 240 тысяч долларов.) Сегодня пиросеквенаторы не продаются: их уже успели вытеснить новые, не менее впечатляющие технологии.

В близком к пиросеквенированию методе – полупроводниковом секвенировании – ставка делается на другой элемент, высвобождаемый при встраивании нуклеотида в растущую нить ДНК⁷.

Он настолько мал и вроде бы незначителен, что опора на его детекцию кажется совсем уж удивительной. Это одиночный протон. Все, что окружает нас, состоит из протонов, нейтронов и электронов. Легчайший из химических элементов, водород, представляет собой совокупность одного положительно заряженного протона и одного отрицательно заряженного электрона. Одинокий протон и того меньше. Обнаруживать его быстро и надежно позволяет совершенно не биологическая технология – транзистор.

Транзисторы – основные компоненты электрических схем мобильных телефонов, компьютеров и несметного числа других электронных устройств. В каждом транзисторе электрический ток течет от одной точки к другой, ориентируясь на указания, поступающие из третьей точки, примерно как движение речных судов подчиняется командам оператора разводного моста. В так называемых полевых транзисторах контролирующим фактором выступает электрическое поле – например, поле протона, находящегося вблизи поверхности транзистора.

Как и при пиросеквенировании, шарики, покрытые фрагментами клонированной ДНК, распределяются по отдельным микролункам. Но эти лунки размещены на полупроводниковом чипе, где у дна каждой из них работает особый полевой транзистор. Вместо вспышек света здесь регистрируются импульсы электрического тока [53] . Эту технологию коммерциализировала компания Ion Torrent, основанная весьма продуктивным биотехнологом Джонатаном Ротбергом, который раньше возглавлял 454 Life Sciences. Ion Torrent представила свой секвенатор Personal Genome Machine в 2010 году⁸. Он умещался на столе и стоил всего 50 тысяч долларов – меньше удвоенной средней стоимости нового автомобиля в том же году.

53

Эти импульсы испускает ионный датчик (ионоселективный транзистор, ISFET), уловивший изменение pH в лунке, которое обусловлено выделением протона при встраивании правильного нуклеотида в растущую цепь ДНК, – принцип последовательного добавления разных типов оснований здесь тот же, что и в пиросеквенировании, но детекционные события запускает выход не пирофосфата, а иона водорода.

Однако господствующая технология секвенирования нового поколения полагается на искусную химическую модификацию ДНК, а не на замысловатую детекцию встраивания нуклеотидов⁹. Как вы помните, в секвенировании по Сэнгеру рост новой цепи ДНК прерывается присоединением модифицированного нуклеотида. К концу 1990-х созрело более гибкое решение – обратимо терминирующие и флуоресцирующие нуклеотиды. Во время репликации, то есть синтеза комплементарной цепи, изучаемого ДНК-фрагмента ученый вводит модифицированные A, Ц, Г или T, каждый из которых флуоресцирует уникальным цветом и обрывает дальнейшее наращивание цепи [54] . После отмывки образца от не встроившихся молекул ученый с помощью лазера регистрирует цвет только что добавленного в цепь нуклеотида. Флуоресцирующий участок и участок, блокирущий работу полимеразы, крепятся к нормальному «телу» нуклеотида цепочкой из атомов, которую можно химически расщеплять. После обработки расщепляющими агентами ученый получает обычную, без терминаторов и меток ДНК, готовую к присоединению следующего нуклеотида, и так процесс раз за разом повторяется. Как правило, реакции проводят на стеклянных плашках, усеянных кластерами реплицирующихся фрагментов ДНК, а камеры фиксируют цветовые вспышки, которые появляются и исчезают в каждом кластере.

54

Перед этой, секвенирующей, реакцией фрагменты геномной ДНК фиксируют с помощью адаптеров и якорных праймеров в микроячейках общей подложки и там же амплифицируют, в итоге подложка оказывается покрытой миллионами кластеров ДНК, каждый из которых содержит около тысячи копий одного исходного фрагмента. Далее ДНК на подложке плавят и в тех же кластерах одноцепочечные молекулы секвенируют с помощью синтеза комплементарной цепи (иллюстративное видео: https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM).

Эта технология известна как метод Illumina – по названию компании, которая приобрела ее разработчика. Инструментарий для такого секвенирования стоит где-то от 100

тысяч до миллионов долларов в зависимости, например, от количества оснований, определяемых за одно прочтение. Как и в других технологиях секвенирования, нужно немало времени и денег, чтобы подготовить образцы ДНК, стеклянные плашки с образцами или другие платформы. Без учета расходов на покупку секвенатора прочитать миллиард ДНК-оснований методом Illumina стоит от 5 до 150 долларов, а методом полупроводникового секвенирования – около 10 тысяч долларов, и это существенно повышает привлекательность первого метода. Ниже я еще вернусь к вопросу стоимости, но хочу отметить, что все эти суммы в любом случае гораздо меньше тех 3 миллиардов долларов, которые ушли на секвенирование 3 миллиардов оснований в исходном проекте «Геном человека».

Читаем слова по одному

Провести черту между вторым и третьим поколениями методов секвенирования сложнее, чем между первым и вторым. Новые техники появляются не взрывоподобно, перемежаясь затишьями, а рождаются в результате непрерывной деятельности на множестве пересекающихся фронтов. Но все же есть удобный и относительно корректный с хронологической точки зрения способ выделить третье поколение: эти методы предполагают секвенирование одиночных молекул ДНК без их амплификации.

Так, в рамках одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT), выведенного на рынок компанией Pacific Biosciences, отдельные молекулы нетипичной ДНК-полимеразы фиксируют в наноячейках на кремниевой подложке с алюминиевым напылением и, прицельно освещая через дно, наблюдают за их работой¹⁰. Подложка обладает такими оптическими характеристиками, что флуоресцирующие разными цветами нуклеотиды видны только в момент их встраивания в растущую молекулу ДНК [55] .

55

Этот метод тоже основан на принципе секвенирования путем синтеза комплементарной цепи. Но матричные фрагменты здесь не нужно множить с помощью ПЦР, и они могут быть очень длинными, до нескольких десятков тысяч оснований (принцип метода лаконично представлен в видео: https://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFc).

В самой интересной из новых технологий секвенирования ДНК, нанопоровой, не используют ни растущую ДНК, ни цветные нуклеотиды, ни даже ДНК-полимеразу¹¹. Здесь можно пренебречь всем, что на последних страницах было написано о методах, в которых секвенирование привязано к синтезу, и вернуться к тому, с чего мы начинали: поочередно определять нуклеотиды на уже сформированной нити ДНК. Как мы помним, различать основания с помощью света невозможно, зато можно рассчитывать на электричество.

Представьте единственную пору нанометрового масштаба в мембране, разделяющей резервуар с жидкостью на два отсека. В водном растворе по обе стороны от нее содержатся ионы – электрически заряженные атомы или молекулы. При приложении к резервуару напряжения ионы начинают проходить сквозь пору, и силу этого электрического тока можно измерить. Если пора частично перекрыта, ток будет слабее – иными словами, сила тока показывает, насколько пора доступна ионам. Теперь представьте, что через пору протискивается нить ДНК. Ее основания – A, Ц, Г и T – различаются числом атомов и размерами, а следовательно, попадая в пору, по-разному снижают силу тока. Чтобы превратить этот принцип в метод секвенирования, нужно уметь оптимально протаскивать ДНК сквозь пору. В первых устройствах отрицательно заряженная по своей природе ДНК перемещалась, как и прочие ионы, под действием разности потенциалов на сторонах мембраны. Но работало это плохо – в основном потому, что молекула проскальзывала через пору слишком быстро и точно измерить силу тока при прохождении каждого нуклеотида не получалось. Как же решили эту проблему? Один из подходов задействовал белки. Существует немало белков, которые в норме передвигаются вдоль ДНК и совершают с ней какие-то действия, – например, ДНК-полимеразы или хеликазы. Если зафиксировать один из таких белков у входа в нанопору (на следующем рисунке изображен как светло-серые спирали¹²), он будет своим обычным рабочим инструментарием размеренно направлять ДНК в пору. Из главы 2 мы узнали, что многие белки можно считать природными машинами нанометровых масштабов. Здесь одну из них нагрузили работой в месте, недоступном для других исполнителей. Кроме того, белки способны формировать и сами поры: как мы выяснили в главе 2, многие пронизывающие мембрану белки могут укладываться так, что внутри них образуется сквозной канал. И вот мы снова наблюдаем самосборку.