Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5
Шрифт:
Современная биотехнология — это наука и отрасль производства, развивающаяся в трех основных направлениях:
— молекулярная биология и генетическая инженерия;
— микробиология и микробиологическая промышленность;
— культура клеток и тканей in vitro.
Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный процесс создания новых сортов и видов. Они предлагают принципиально новые пути, такие как сомаклональная изменчивость,
В данном пособии представлены наиболее простые для освоения студентами биологических и сельскохозяйственных специальностей способы культивирования растений in vitro: метод апикальной меристемы; получение каллусов, суспензий и растений — регенерантов как на диплоидном, так и гаплоидном уровне.
По каждой теме предусмотрены: минимум теоретического материала, методика выполнения работы, перечень необходимого оборудования и реактивов. После каждой темы приводятся контрольные вопросы.
Тема I. ТЕХНИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА НА ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
Работа 1. ОРГАНИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Объяснение. Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы.
Для удобства проведения дезинфекции полы и стены в помещениях должны иметь кафельное покрытие, а потолок должен быть побелен.
Оборудование моечной комнаты: мойки с горячей и холодной водой; дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды — до 100–130 °C, для инструментов — до 170 °C; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H2SO4 98 % + К2СrО7).
Оборудование комнаты для приготовления питательных сред: лабораторные столы; холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и витаминов; аналитические и торсионные весы; иономер; магнитные мешалки; плитки, газовые горелки; набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).
Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы — давление 1–2 атмосферы и температура 120 °C; стеллажи для штативов с питательными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.
Оборудование комнаты для инокуляции растительных эксплантов на питательные среды: ламинар-боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные лампы, шкафы для материалов и
Оборудование культуральных комнат: световое отделение — источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25+ — 2 °C) и влажности воздуха (70 %), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение — с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха.
Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.
Материалы и оборудование. Химические стаканы (50, 100, 250 мл), штативы с пробирками, инструменты (пинцеты, скальпели, препарировальные иглы), моющие средства (стиральный порошок), хромпик.
Ход работы.
1. Ознакомиться с устройством биотехнологической лаборатории.
2. Под руководством преподавателя освоить принципы работы автоклава, сушильных шкафов, дистиллятора.
3. Посуду тщательно отмыть в растворах детергентов (стиральный порошок), промыть 8-10 раз проточной водой, поместить на 4–6 часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия), промыть теплой водой, затем дважды дистиллированной и бидистиллированной.
4. Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 2 часа при температуре 100–130 °C.
5. Сухую посуду для хранения закрыть ватными пробками, фольгой, целлофаном.
Работа 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ IN VITRO
Объяснение. Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, ис точники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.
Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора — в виде фосфатов; серы — в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са++, Мg++. Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2О4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] — наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.