Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5
Шрифт:
6. Весь растительный материал перенести в культуральную комнату.
7. Результаты зарисовать через 2-4-6-8 недель.
Работа 7. ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЗВИРУСНОГ0 ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ХИМИОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С МЕТОДОМ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ.
Объяснение. Для химиотерапии используют специальные вещества-ингибиторы вирусов: ферменты, влияющие на нуклеиновые кислоты (РНК-азы). Непосредственную обработку клубней ферментом можно проводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение 20 минут, что приводит к большому расходу вещества.
РНК-аза стимулирует рост и развитие растений из апексов и ингибирует развитие вирусов. В результате применения такой технологии выращивания на 10–35 % повышается приживаемость меристем на питательных средах, на 30–40 % больше образуется растений-регенерантов.
Материалы и оборудование. Пробирки с питательными средами, ламинар-бокс, фильтры Зейтца, стерильная бидистиллированная вода, флаконы с 96 % спиртом, спиртовки, микроскопы МБС-9 или МБС-10, стерильные инструменты (скальпели, препарировальные иглы, пинцеты), раствор РНК-азы (0,01 н), химическая посуда (колбы на 50-100 мл, стаканы на 50-100 мл, мерные цилиндры), проростки картофеля.
Ход работы.
1. Раствор РНК-аЗы профильтровать через фильтр Зейтца, добавить в 100 мл среды Мурасиге-Скуга и разлить в пробирки с застывшей стерильной средой до 0,5 см.
2. Простерилизовать проростки картофеля в 6 % хлорамине 5 минут.
3. Проростки промыть стерильной дистиллированной водой и поместить в стерильные чашки Петри.
4. В условиях ламинар-бокса под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить на среды без фермента (контроль) и с ферментом (опыт).
5. Пробирки с меристемами перенести в культуральную комнату.
6. Результаты зарисовать через 2-4-6 недель, сделать выводы.
ТЕМА III. ДЕДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.
Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ ТАБАКА.
Объяснение. Каллусная клетка, в результате деления которою возникает кал лус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки. Для растения in vivo каллус — это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место поранения (раневая паренхима). В ней накапливаются питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа.
Дифференцированные клетки объединяются в растении в ткани и выполняют оп ределенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.
На питательных средах с большим содержанием ауксинов (2,4 Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференциации клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус.
В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки-антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация
Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематическои активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.
В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Поэтому большинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4 Д).
Материалы и оборудование. Растения табака, 6 % раствор хлорамина, колбы со стерильной дистиллированной водой, чашки Петри со стерильной питательной средой для индукций каллусогенеза.
Ход работы.
1. Листья табака поместить в стерилизующий раствор на 5 минут, затем промыть стерильной дистиллированной водой 3 раза.
2. Стерильным скальпелем вырезать срединную жилку листа с участком паренхимы: длиною 1,5–2 см, шириной 1 см.
3. Поместить экспланты на питательные среды (перед каждой манипуляцией инструменты обрабатывать спиртом и обжигать на пламени спиртовки).
4. Чашки Петри с эксплантами перенести в термостат для индукций каллусогенеза при температуре 25 + 2 °C.
5. Результаты зарисовать через 2–4 недели.
Работа 2. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ И УЗЛОВ КУЩЕНИЯ ПШЕНИЦЫ.
Объяснение. Каллусы из различных органов пшеницы на искусственных питательных средах впервые были получены в 1968 году. Их можно использовать для изучения солеустойчивости, устойчивости к температурному стрессу, получения суспензий и протопластов.
Для индукции каллусогенеза обычно используют стерильные пробирочные растения, выращенные из зародышей на средах без гормонов.
Растения для получения каллусов можно вырастить в теплице. Для этого набухшие семена помещают на 5 недель в холодную камеру на яровизацию при 2 °C, проростки высаживают в вегетационные сосуды и выращивают до достижения молочною спелости. Незрелые зародыши выделяют и переносят на питательные среды.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой, пробирки со стерильными растениями, колосья пшеницы в стадии молочной спелости, инструменты: препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, стерильная бумага, 6 % раствор хлорамина, стерильная дистиллированная вода, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом.