Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5
Шрифт:
Апикальные меристемы проростков изолируют на 12–13 пластохроне[1]. Изолированные меристемы культивируют в асептических условиях на питательных средах с богатым содержанием макро- и микросолей, с повышенной концентрацией цитокининов (6-ЕАП 2 мг/л). В культуральной комнате с кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25 + 2 °C, влажность воздуха 70 %, освещенность 5 kLx и фотопериод 16 часов.
В среднем от посадки меристемы на среду до формирования проростков с 5–6 листочками проходит 30–45 дней, в некоторых случаях от 2 до 8 месяцев. Среды по мере истощения
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, флаконы со стерилизующими растворами, (0,2 % диацид или 70 % спирт), чашки Петри, стерильная дистиллированная вода, стерильные инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, скальпели, спиртовка, пробирки со средой.
Ход работы.
1. Поверхность ламинара, штативы, пробирки, микроскоп обработать ультрафиолетом и 96 % спиртом. Руки протереть спиртом. Препарировальные иглы, пинцеты, скальпели поместить в 96 % спирт и перед каждой манипуляцией обжигать на пламени спиртовки.
2. Проростки (2 см) отделить от клубней и поместить в чашки Петри со стерилизующими растворами: в диацид на 3–5 минут, в спирт на 1–2 минуты.
3. Проростки промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой и перенести в стерильные чашки Петри.
4. Тонкой препарировальной иглой у проростков удалить все листья, последовательно обнажая верхушечные и боковые меристемы с примордиями.
5. Меристему с 1–2 примордиями отделить от проростков, при этом величина экспланта должна быть не более 100–250 мкм.
6. Экспланты перенести в пробирку на поверхность питательной среды.
7. Пробирки закрыть пробками, поместить в штатив и перенести в культуральную комнату.
8. Результаты зарисовать через 2–4 недели, сделать выводы.
Работа 2. ПРОЛИФЕРАЦИЯ ПОБЕГОВ И МИКРОЧЕРЕНКОВАНИЕ СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ.
Объяснение. Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляют с помощью черенкования. Такое размножение основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных почек на питательных средах образуются побеги. Растения, сформировавшие 5–6 листочков, в стерильных условиях извлекают из пробирок и разрезают на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные среды либо без гормонов, либо с добавлением ауксинов.
Черенки культивируют в тех же условиях, что и меристемы: при температуре 24–25 °C днем и 19–20 °C ночью, освещенности 5–6 kLx и продолжительности фотопериода 16 часов.
Рост стебля и корней начинается на 3–4 день после посадки на питательную среду, а полностью растения формируются через 12–15 дней.
Каждое последующее черенкование проводят через 14–20 дней. Из одного растения можно получить 5–8 черенков, а через 2–3 месяца — 3–5 тыс. черенков.
Нижнюю часть растения используют для ИФА. Растения, зараженные вирусами, бракуют, а здоровые дают начало мериклонам (меристематическим клонам).
Если почки или черенки высадить на питательные среды с высоким содержанием цитокининов, то
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с проростками, пробирки с питательной средой, скальпели, препарировальные иглы, спиртовка, флакон с 96 % спиртом.
Ход работы.
1. Подготовить ламинар-бокс и инструменты к работе.
2. В ламинаре извлечь стерильные проростки из пробирок.
3. Побеги разделить на микрочеренки (междоузлие с почкой) и посадить в питательную среду на глубину междоузлия.
4. Пробирку закрыть пробкой, поместить в штатив и перенести в культуральную комнату.
5. Результаты зарисовать через 2–4 недели. Сделать выводы о степени пролиферации почек различных сельскохозяйственных культур.
Работа 3. ИНДУКЦИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ РАСТЕНИЙ.
Объяснение. Для укоренения растений, образовавшихся при микрочеренковании, их необходимо пересадить на новую питательную среду. Черенки и побеги легко укореняются на средах с обедненным составом минеральных солей (среда Уайта, Мурасиге-Скуга, разбавленная вдвое), либо на средах с добавлением ауксинов: ИУК, НУК, ИМК.
Проростки, сформировавшиеся в пробирках со средами, можно рассматривать как небольшие укорененные растения, которые необходимо адаптировать к обычным условиям выращивания. Такие растения лучше пересаживать в грунт, когда полностью сформируются 5–6 листьев и достаточно разрастутся корни. Однако, разные виды культурных растений по-разному приспосабливаются к изменению условий среды. Каждое растение требует специально подобранных условий культивирования в грунте, которые устанавливают экспериментально.
Материалы и оборудование. Пробирки с проростками, пробирки с питательными средами для индукции корнеобразования: без гормонов и с добавлением ИУК, стерильные инструменты, ламинар-бокс, спиртовки, флакон с 96 % спиртом, вата, стерильные чашки Петри.
Ход работы.
1. В стерильных условиях проростки извлечь из пробирок и стерильным пинцетом перенести в пробирки с питательными средами для укоренения.
2. Пробирки с пересаженными растениями поставить в штативы и перенести в культуральную комнату с освещением 5 kLx, температурой 25 + 2 °C и влажностью воздуха 70 %.
3. Результаты укоренения оценить через 1–4 недели, сделать рисунки.
4. Укоренившиеся растения перенести в ящики или вегетационные сосуды с торфом и песком (3:1).
Работа 4. ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO
Объяснение. В практике биотехнологии на искусственных питательных средах с определенным набором биологических регуляторов можно вызвать пролиферацию почек и побегов, укоренить их, а также индуцировать образование микроклубней. Для этого обычно используют среды с высоким содержанием минеральных солей (Мурасиге-Скуга), углеводов (сахарозы до 8 % от объема среды), цитокининов, абсцизовой кислоты, хлорхолинхлорида.