Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5
Шрифт:
Ход работы.
1. Незрелые зерновки поместить в стерилизующий раствор на 5 минут.
2. Промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой.
3. Простерилизованные зерновки поместить на стерильные бумажные мости ки.
4. Препарировальной иглой вычленить зародыши и перенести в пробирки с питательными средами.
5. Пробирки с зародышами закрыть пробками и поставить в штатив.
6. Пробирочные растения пшеницы выложить на стерильные бумажные матрасики и разрезать на небольшие части по 5-10 мм, выделить междоузлия с участками листового влагалища.
7. Перенести экспланты
8. Зарисовать каллусы через 2–4 недели, сделать выводы о морфологии каллусов, рассмотреть каллусные клетки под микроскопом.
Работа 3. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ КОРЕШКОВ ФАСОЛИ.
Объяснение. Каллусы можно получать из разных частей растения, в том числе из кончиков корней. Образование каллуса происходит в области первичных и вторичных меристем. Процесс каллусообразования зависит от размера экспланта. Оптимальная величина экспланта 5-10 мм3 и масса 20-100 мг.
Многие ткани имеют физиологическую полярность. Поэтому каллус лучше образуется на той стороне экспланта, которая ближе к апикальным меристемам корня. Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на среду горизонтально, тогда как сегменты стебля лучше формируют каллус, если их поместить вертикально.
Для культивирования на питательных средах лучше использовать стерильные корешки, полученные при проращивании семян в стерильных условиях.
Материалы и оборудование. Семена фасоли, 6 % раствор хлорамина, стерильные инструменты: пинцеты, скальпели, препарировальные иглы, чашки Петри с пита тельными средами для индукции каллусогенеза, стерильные чашки Петри, флаконы со спиртом и стерильной дистиллированной водой.
Ход работы.
1. Семена фасоли поместить в чашки Петри (по 15 штук в чашку), залить раствором хлорамина до полного погружения семян в жидкость и оставить на 20 минут.
2. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.
3. Стерильные семена залить стерильной водой и оставить для набухания на 24 часа.
4. Семена с разрушенной кожурой удалить, а жизнеспособные семена простерилизовать повторно 6 % хлорамином 20 минут.
5. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.
6. Семена перенести в стерильные чашки Петри (по 5 штук в чашку).
7. Стерильным пинцетом придерживать семя, а стерильным скальпелем надрезать оболочку.
8. Стерильным скальпелем и препарировальной иглой изолировать корешки (2-
3 мм) и перенести в чашки Петри со стерильной дистиллированной водой (по 15 штук в чашку).
9. Корешки стерильной препарировальной иглой поместить на поверхность агаризованной среды и слегка вдавить в агар для обеспечения хорошего контакта со средой (среда ШХ+10 мг/л п-ХФУК+2 мг/л 2,4Д+0,1 мг/л кинетина).
Работа 4. СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ КАЛЛУСОВ.
Объяснение. В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный онтогенез: растут растяжением, дифференцируются и деградируют. Рост каллуса внешне отражает образная кривая. Ростовой цикл начинается с посадки экспланта на среду (начало культивирования), а завершается в момент прекращения митозов (стационарная
В лагфазе (латентной фазе) клетки не делятся, не увеличиваются в размере, имеют низкую метаболическую активность. В экспоненциальной фазе (фазе логарифмического роста) клетки активно делятся митозом. В ранней экспоненте увеличивается количество митохондрий (синтезируется АТФ), рибосом, всех видов РНК, синтезируются белки, активизируется метаболизм, интенсивно поглощается кислород. Поздняя экспонента или фаза латентного роста, характеризуется снижением удельной скорости роста, замедлением клеточного деления, увеличением среднего размера клеток за счет растяжения. В стационарной фазе размер клеток продолжает увеличиваться, а их деление прекращается. В поздней стационарной фазе (фаза деградации) за счет истощения среды клетки стареют и умирают.
Продолжительность ростового цикла каллусных клеток 21–28 дней. В процессе культивирования каллус пассируют (пересаживают на свежую питательную среду) каждые 4–6 недель. Масса транспланта (фрагмента ткани, который пассируют на свежую питательную среду) составляет 60-100 мг на 20–40 мл среды.
Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами, пробирки с питательной средой для культивирования каллусов, инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, флакон с 96 % спиртом, ламинар-бокс, спиртовка.
Ход работы.
1. В асептических условиях извлечь каллусы из пробирок и поместить на стерильную поверхность (столик ламинар-бокса, обработанный 96 % спиртом и УФ-излучением), стерильной препарировальной иглой выделить зоны меристематической активности (белые мелкие клетки).
2. Транспланты величиной 2–3 мм поместить на поверхность питательной среды (МС+ИУК — 0,5 мг/л + кинетин — 0,5 мг/л).
3. Результаты культивирования зарисовать через 2–4 недели, по результатам взвешиваний через 1-2-3-4 недели построить график роста каллуса.
ТЕМА IV. СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ.
Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ СУСПЕНЗИИ.
Объяснение. Суспензионные культуры — это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2–3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60-100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100–120 об./мин.
Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток.
Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве.