Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5
Шрифт:
Ход работы.
1. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии (в верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток) и смешать с 5 мл агаризированной (1,4 % агара) среды для культивирования каллуса. Работу проводить в стерильной посуде: мерном цилиндре, стакане.
2. Полученную смесь разлить в стерильные чашки Петри слоем до 1 см.
3. Чашки Петри закрыть крышками и герметизировать парафином.
4. Количество колоний подсчитать через 4–6 недель.
5. Результаты зарисовать, подсчитать
Эффективность высева = количество образовавшихся колоний х 100 % / количество высеянных клеток
ТЕМА V. ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.
Работа 1. ИНДУКЦИЯ ОРГАНОГЕНЕЗА И СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА В КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ТАБАКА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФИТОГОРМОНОВ.
Объяснение. Фитогормоны — это биологические регуляторы роста и развития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность фаз индивидуального развития.
По химической природе гормоны растений четко подразделяются на две группы: производные мевалоновой кислоты (гиббереллины, абсцизины, брассины, фузикокцин, цитокинины), производные аминокислот (ауксины — из триптофана, этилен — из метионина и аланина). Биосинтез фитогормонов происходит в определенных частях растений: в апексах побегов образуется ИУК-индолил-3-уксусная кислота, лист служит донором ключевого продукта синтеза гиббереллинов — каурена, а также абсцизовой кислоты, в апексах корней синтезируется кинетин, а в зоне растяжения корня — гиббереллины, источником зеатина является эндосперм проростающих семян.
По функциональному действию различают 5 основных групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентрациях — деление клеток, в сочетании с цитокининами — органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические [ИМК (индолил-3-масляная кислота), ИПК (индолил-3-пропионовая кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК(нафтилуксусная кислота)].
Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин (6-фурфуриламинопурин), NN-дифенилмочевина (кокосовое молоко); к синтетическим — 6-ЕАП (6-бензиламинопурин).
Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов
Абсцизины (АБК — абсцизовая кислота) и этилен ингибируют ростовые процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами и хлорхолинхлоридом индуцируют органогенез (образование микроклубней).
Гормональная система тесно связана с генетическим аппаратом клетки. Фитогормоны не только влияют на степень метилирования ДНК и таким образом регулируют экспрессию генов, но и связываются с белками — репрессорами на опероне, что приводит к активации структурных генов и синтезу определенных ферментов.
Следовательно, изменяя соотношение гормонов в питательных средах, можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток и тканей. Эти процессы известны как дедифференциация, редифференциация и дифференциация клеток и тканей.
Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами табака, колбы на 50 мл со стерильном питательной средой (МС без гормонов), колбы со средами для стеблевого органогенеза и соматического эмбриогенеза и индукции ризогенеза, флаконы с 96 % спиртом, стерильные пинцеты и препарировальные иглы, спиртовка, ламинар-бокс.
Ход работы.
1. Стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, разделить на кусочки 5x5 мм. и поместить в колбы с питательными средами, содержащими различные наборы фитогормонов.
2. Колбы перенести в культуральную комнату с температурой 25 + 2 °C, влажностью воздуха 70 % и интенсивностью освещения 5kLx.
4. Результаты эксперимента зарисовать через 2-4-6-8 недель.
Работа 2. ИНДУКЦИЯ ДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК И РОСТА КЛЕТОК РАСТЯЖЕНИЕМ ПОД ДЕЙСТВИЕМ АУКСИНА И ГИББЕРЕЛЛИНА.
Объяснение. В растении фитогормоны находятся в тесном взаимодействии друг с другом: ИУК индуцирует синтез этилена и цитокининов, ГК увеличивает содержание ИУК, цитокинины усиливают синтез МУК, но снижают содержание свободной АБК, этилен тормозит транспорт ИУК и увеличивает содержание АБК.
В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных пропорциях, регулируют синтез эндогенных гормонов растений, что проявляется в разнообразных морфогенетических реакциях клеток и тканей.
В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило Скуга-Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.