Руководство по репродукции и неонатологии собак и кошек
Шрифт:
Пастеризованные сливки 12 % жирности — 8 мл;
Яичный желток 20 % от объема — 2 мл.
Охлаждение при транспортировке обеспечивают, помещая образец в термос, частично заполненный колотым льдом. Для перевозки образца используют пластиковые пробирки для центрифуги (например, пробирку на 10 мл с завинчивающейся крышкой для клеточной культуры).
Пробирку с образцом помешают в изолированную колбу, колбу кладут в термос поверх слоя льда и оборачивают бумагой. Перед осеменением сперму постепенно согревают до 30–35 °C.
Замораживание
В литературе имеется подробное описание множества протоколов разведения, замораживания и размораживания спермы. Автор настоящей главы предпочитает работать с разбавителем TRIS, обеспечивающим хороший результат при хранении спермы собак и лисиц. Успешность последующего осеменения составляет 67–80 % при внутриматочном осеменении с использованием спермы с концентрацией 50–150 х 106 сперматозоидов в спермодозе и проведением осеменения в два приема с интервалом в 24 часа.
ОБРАБОТКА И ЗАМОРАЖИВАНИЕ СПЕРМЫ СОБАК
Для замораживания к основному раствору TRIS добавляют глицерин и антибиотики (табл. 9.1). Объем добавляемого глицерина составляет от 12 до 16 мл (6 и 8 % общего объема соответственно) в зависимости от техники замораживания: для автоматического замораживания добавляют 6 % глицерина, для ручного — 8 %. В раствор добавляют дистиллированную воду (188 или 184 мл вместо стандартных 200 мл).
В базовый раствор TRIS с глицерином добавляют 20 % яичного желтка. Яичный желток получают от кур, проверенных на отсутствие патогенных факторов (предназначенных на экспорт или домашних). Желток отделяют от белка, выкладывают на лист чистой бумаги, осторожно прокалывают и сливают в воронку и энергично взбивают стеклянной лопаткой, максимально измельчая его частицы, — это позволяет снизить связывание головок сперматозоидов частицами желтка, затрудняющее анализ спермы. Наконец, желток смешивают с буферным раствором TRIS, предварительно подогретым до 30 oС. Смесь хорошо взбалтывают и нагревают до 35 oС. Предварительно приготовленный разбавитель можно замораживать и сохранять в таком виде в течение 2 месяцев. Перед применением его размораживают на водяной бане при температуре 35 oC.
Проводят микроскопическое исследование спермы на соответствие перечисленным выше критериям, затем ко второй фракции эякулята добавляют по каплям подогретый до 35 oС разбавитель, пока необходимая концентрация не будет достигнута. В лаборатории автора для замораживания обычно используют образцы с общей концентрацией сперматозоидов 100 х 106/мл. Однако при высоком качестве спермы концентрацию можно уменьшить наполовину.
После разбавления несколько капель образца исследуют под микроскопом, а разбавленную сперму сливают в пластиковые центрифужные пробирки, которые помещают в сосуд с водой, подогретой до 35 °C. Затем сосуд переносят в холодильник и оставляют на 2 часа при температуре 4 °C. За это время сперма охлаждается до 4–5 °C, а глицерин, выполняющий роль защитного фактора, проникает в мембрану сперматозоидов.
Сперму вынимают из холодильника, осторожно взбалтывают и немедленно помещают в пластиковые соломины (пайетты) емкостью 0,5 мл. Для выполнения процедуры применяют специальный отсос или насасывают ртом через латексную трубку. При распределении спермы следует проследить за тем, чтобы порошок, находящийся между концами фильтров соломины, пропитался жидкостью и затвердел. Сначала соломины заполняют наполовину, после чего, оставляя пузырек воздуха, доливают, не доводя 1 см до верха. Пузырек
Существуют два альтернативных метода заморозки — ручная (статический протокол) и автоматическая (динамический протокол). Доля глицерина в составе разбавителя зависит от применяемого метода. При ручной заморозке используют контейнер (30 х 40 х 30 см) из полистирола со съемной металлической полкой, помещенной на 10 см ниже края. Контейнер заполняют жидким азотом до уровня, находящегося на 4 см ниже полки.
Заполненные соломки (8–10 максимально) захватывают пинцетом, помещают горизонтально на полку и оставляют в испаряющемся азоте на 8 минут. Затем пинцет охлаждают в жидком азоте, приподнимают и поворачивают с его помощью пайетты, одну за другой, чтобы удостовериться в полной кристаллизации их содержимого. После этого пайетты погружают в жидкий азот. Такую процедуру называют статической в связи с присутствием постоянного нерегулируемого потока испаряющегося азота в период охлаждения и заморозки.
Автоматическая заморозка подразумевает использование машины. Такой способ называют динамическим, поскольку испаряющийся азот поступает в морозильную камеру с различной скоростью в зависимости от заданной программы, позволяющей регулировать темпы заморозки. Программа заморозки осуществляется автоматом Planer 10™, разработанным Hofmo (1988) для замораживания спермы лисиц. В настоящее время этот прибор используется в лаборатории автора, располагающей обширным запасом образцов спермы. Пайетты замораживают в горизонтальном положении на полке со съемной крышкой, причем в морозильной камере может находиться несколько таких полок. Программа заморозки включает следующие режимы:
• -2 oС/мин. начиная с +4 °C до -7 °C;
• -50 oС/мин. от -7 °C до -100 °C;
• -25 oС/мин. от -100 oС до -180 °C.
после окончания процедуры полку помещают непосредственно в жидкий азот.
Пайеггы размораживают на водяной бане (в термосе) при температуре 70 oС в течение 8 секунд. После размораживания их ставят вертикально фильтром вниз, распечатывают крышку, встряхивают, чтобы пузырек воздуха мог подняться вверх. Соломку вскрывают и несколько капель образца помещают на подогретое предметное стекло для оценки параметров спермы после размораживания. До восстановления подвижности сперматозоидов проходит некоторое время, обычно 2 минут бывает достаточно. В связи с тем, что разные лаборатории используют различные техники замораживания, при размораживании образца спермы, полученного из какой-то определенной лаборатории, необходимо строго соблюдать все полученные оттуда рекомендации, поскольку процессы замораживания и размораживания тесно связаны между собой.
ИСКУССТВЕННОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ
Практикуется в случаях, если естественная вязка невозможна по ряду причин: кобель и сука живут довольно далеко друг от друга; заводчик намерен осеменить несколько сук или опасается прямого контакта суки с производителем в связи с распространенностью инфекционных заболеваний.
Обычно предпринимают, если производитель находится далеко, а отправить свежую сперму не представляется возможным, либо в связи с запретом провозить через границу свежую сперму, либо в случае гибели производителя. В Европе и США существуют банки спермы в национальных собачьих клубах, в научных институтах и в некоторых частных компаниях.