Руководство по репродукции и неонатологии собак и кошек
Шрифт:
Искусственная вагина для сбора спермы состоит из резинового «пальца» и пробирки
Получение спермы с помощью искусственной вагины
Манипуляция не требует предварительной подготовки кота, однако проводится под общей анестезией для того, чтобы животное не испытывало неприятных ощущений. В прямую кишку вводят ректальный зонд (1 x 12 см), изготовленный из нетоксичного пластика и соединенный с электрическим стимулятором (фиг. 10.5). Зонд снабжен тремя электродами (1,5 мм х 5 см), два из которых (наружные) соединяют
Оборудование для электроэякуляции у котов. Электрический стимулятор и ректальный зонд с тремя электродами
После проведения анестезии зонд смазывают и осторожно вводят в прямую кишку на 7–9 см, направляя электроды вентрально. Пенис обнажают легким нажатием на его основание и подносят к нему лабораторную пробирку. Серия из 80 импульсов мощностью от 2 до 5 вольт обеспечивает эякуляцию (табл. 10.2). Общая последовательность манипуляций включает три серии: 30 стимуляций (по 10 при 2, 3 и 4 вольтах), 30 стимуляций (по 10 при 3, 4 и 5 вольтах) и 20 стимуляций (по 10 при 4 и 5 вольтах). Между сериями делают паузы продолжительностью 2–3 минуты. Стимуляцию начинают, повышая напряжение в течение 1 секунды с 0 вольт до требуемого, после чего выдерживают 2–3 секунды при этом напряжении и резко снижают его до 0, снова выдерживая 2–3 секунды. Существуют иные методики, предусматривающие другие напряжения и длительность стимуляций. Каждый разряд сопровождается реакцией, выражающейся в вытягивании задних конечностей, что указывает на адекватность раздражения. Отсутствие реакции при напряжении 2 вольт и более свидетельствует о неправильном положении электродов или о наличии в прямой кишке каловых масс. В ходе эякуляции часть сперматозоидов попадает в мочевой пузырь, эта особенность эякуляторного процесса является нормой для домашних кошек, но может усиливаться в результате применения альфа-2 стимуляторов адренорецепторов (ксилазин и медетомидин) для седации.
Метод не распространен в клинической практике, поскольку лишь немногие коты способны к вязке в незнакомом месте, тем более в клинике. Другой недостаток метода заключается в необходимости назначения кошке седативных препаратов, а также в том, что секрет влагалища и жидкость, используемая для процедуры (солевой раствор, подогретый до 37 °C), могут влиять на качество спермы. Метод практикуют при невозможности получить сперму с применением искусственной вагины или электроэякуляции.
После кастрации сперму получают из хвоста придатка путем вымывания сперматозоидов из протока придатка или измельчения хвоста придатка. Метод применяют при сборе спермы для научных исследований или при необходимости сохранить сперму редкого вида диких животных, погибших в неволе или в результате несчастного случая.
Все материалы, соприкасающиеся со спермой, должны быть подогреты до 37 oС для предотвращения холодового шока
Белый: высокая концентрация.
Прозрачный: низкая концентрация.
Желтый: контаминация мочой, оказывающей разрушительное воздействие на сперму, часто наблюдается при повышении напряжения свыше 8 вольт при электроэякуляции.
Измеряется с помощью микропробирки. Перед дальнейшим применением небольшой объем может быть увеличен добавлением буферного или изотонического раствора. Оценку морфологии сперматозоидов проводят перед смешиванием с раствором, поскольку разница в осмотическом давлении может увеличить количество дефектных сперматозоидов.
Подвижность сперматозоидов оценивают по шкале от 0 до 5. Нулевой подвижностью считают ее отсутствие, за 5 принимают активное поступательное продвижение.
Измеряют с помощью специальной камеры (камера Бюркера) под микроскопом. Общее количество сперматозоидов подсчитывают с учетом объема и концентрации на единицу объема
Окрашенный образец (карбол-фуксин или нигрозин-эозин) исследуют под микроскопом с 1000-кратным увеличением. Дефектными считают: головку в форме «жемчужины»; головку, имеющую суженное основание, нарушения контура, недоразвитую, отделенную или узкую головку; а также головку, имеющую отклонения в размерах.
Образец фиксируют в формалине и исследуют под фазово-контрастным микроскопом при 1000-кратном увеличении. Дефектами сперматозоидов считают проксимальные включения, дистальные включения, утрату головки, дефекты акросомы, изменения акросомы, изменения тела, удвоение хвостов. К дефектным также относят сперматозоиды, сцепленные хвостами. Кроме того, подсчитывают количество сперматозоидов, не имеющих дефектов.
В окрашенном образце подсчитывают количество лейкоцитов, сперматогенных клеток и дегенеративных эпителиальных клеток (по Папаниколау).
У котов объем эякулята небольшой (до 0,01–0,77 мл). Если сперму собирают с помощью электроэякуляции, то из-за более интенсивной стимуляции добавочных желез ее объем заметно больше, чем при получении с помощью искусственной вагины. Общее количество сперматозоидов в эякуляте составляет от 3 х 106 до 153 х 106, обычно оно выше, когда сперму собирают с помощью искусственной вагины, чем если ее получают методом электроэякуляции. Подвижность сперматозоидов различна и может быть связана с продолжительностью сексуального воздержания. Осмоляльность свежей спермы, собранной с помощью искусственной вагины, составляет около 320 мосм/кг и возрастает при хранении. Сперма содержит много алкалин фосфатазы, ее рН колеблется между 6,6 и 8,77. Содержание нормальных сперматозоидов на уровне 60 % и более считают нормой, при показателе менее 40 % можно говорить о тератозооспермии. Однако связь между качеством спермы и фертильностью у домашних кошек нуждается в дальнейшем изучении. В естественных условиях нормальная фертильность наблюдается и при менее чем 40 % содержании нормальных сперматозоидов в эякуляте. Если сперму получают методом электоэякуляции два раза за короткий промежуток времени, то во втором образце, как правило, отмечается большая подвижность и более высокий процент здоровых сперматозоидов. Был проведен эксперимент: от 15 котов разных пород 2 раза за время одной анестезии брали сперму методом электроэякуляции. Оказалось, что количество здоровых сперматозоидов в первом эякуляте составляет 40,9 %, тогда как во втором возрастает до 54,6 %, притом что первый эякулят отличается более высокой концентрацией. Из изложенного следует, что для определения фертильности целесообразно проводить несколько анализов спермы.
ХРАНЕНИЕ СПЕРМЫ И ИСКУССТВЕННОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ
Сперму сохраняют в течение 24–48 часов в охлажденном буферном растворе. Если предполагается длительное хранение, ее замораживают. В большинстве случаев определение параметров спермы после хранения проводят in vitro, хотя данных об успешном оплодотворении кошек спермой, подвергавшейся длительному хранению, немного.
В связи с тем, что качество спермы котов исследуют in vitro, результаты осеменения предсказать трудно. Для хранения спермы при температуре 4–5 °C применяют Test-T буфер (табл. 10.4), содержащий 20 % яичного желтка и 5 % глицерина. Хранение приводит к снижению подвижности сперматозоидов и процентного соотношения неповрежденных акросом. Повышенное содержания желтка и Сахаров снижает подвижность сперматозоидов при хранении, поэтому простой TesT-буфер, не содержащий Сахаров или желтка, вполне пригоден для разбавления спермы.
N-трис-гидроксиметил-метил-2-аминометан-сульфоновая кислота (Tes) — 11,2 г в 150 мл дистиллированной воды;
Трисгидроксиметиламинометан (Tris) — 2,9 г в 75 мл дистиллированной воды;
Пенициллин В — 1000 МЕ/мл;
Стрептомицин — 1 мг/мл.
* Tes доводится до рН 7,4 This буфером. Желток и глицерин добавляют в случае, если раствор предполагается использовать для замораживания спермы (при охлаждении это необязательно).
Деионизированная вода — 76 мл;
Лактоза — 11 г;
Глицерин — 4 мл;
Сульфат стрептомицина — 1000 мг/мл;
Пенициллин G — 1000 МЕ/мл;
Яичный желток — 20 мл.
Сперму котов замораживают в желточно-лактозном буфере (табл. 10.5). Замораживание в гранулах и пайеттах дает сопоставимые результаты в отношении сохранения подвижности сперматозоидов, доли сперматозоидов с неповрежденным акросомами, проникновения через zona pellucida и связывания с оолеммой. Свежую сперму разбавляют раствором Ham's F 10 в соотношении 1:3 (с добавлением 5 % эмбриональной сыворотки телят), центрифугируют, затем смешивают с буфером. Разбавленную сперму помещают в 0,25 мл пайетты, оставляют на 10 минут при температуре 22 °C и на 60 секунд вручную опускают в пары жидкого азота, охлаждают там до -10 °C, после чего замораживают до -100 oС, понижая температуру со скоростью -40 °C/мин, затем опускают в жидкий азот. Сперму размораживают в течение 10 секунд на воздухе, затем в течение 20 секунд на водяной бане при температуре 37 °C, после чего смешивают с раствором Ham's F 10. Кроме названного раствора, для разбавления спермы применяют буферы TesT и Трис. Подвижность сперматозоидов и количество неповрежденных акросом снижаются после размораживания.