Полный справочник медицинской аппаратуры

Коллектив авторов

В каждом малом квадрате подсчитывают эритроциты, находящиеся внутри него, а также расположенные, например, на левой и верхней границах квадрата, пропуская эритроциты, лежащие на нижней и правой границах. Это позволяет добиться того, чтобы клетки, расположенные на границе квадратов, не считались дважды.

Количество эритроцитов в 1 мкл (1 мм ³) крови рассчитывают по формуле:

X= aх 200/b х 80,

где Х– число эритроцитов в 1 мкл крови, а– число сосчитанных эритроцитов, Ь– объем малого квадрата (2,5 х 10 ^{– 4}мкл), 200 – разведение крови, 80 – число малых квадратов, в которых

производился счет.

Если ввести в эту формулу значение объема одного малого квадрата сетки Горяева, можно получить упрощенную формулу подсчета форменных элементов:

Х= ах 200/80 х 2,5 х 10 ^{– 4}= ах 200/200 х 10 ^{– 4}= а/10 ^{– 4}= ах 10 ⁴.

Количество эритроцитов в 1 мкл (Х)равно числу форменных элементов крови, подсчитанных в 80 малых квадратах, умноженному на 10 ⁴:

Х= ах 10 ⁴.

Например, в 5 больших квадратах (80 малых) сосчитано 456 эритроцитов. Тогда количество эритроцитов в 1 мкл составит 4 560 000, или примерно 4,5 х 10 ⁶/мкл. Учитывая, что в 1 л жидкости содержится 10 ⁶мкл, число подсчитанных эритроцитов можно выразить следующим образом: 4,5 х 10 ¹²/л. Это последнее обозначение числа форменных элементов является в последние годы общепринятым.

Подсчет количества лейкоцитов в счетной камере проводят аналогичным образом. Однако каплю крови (0,02 мл) разводят в 20 раз 3–5%-ным раствором уксусной кислоты (0,4 мл), гемоли-зирующей эритроциты. Затем разведенной взвесью клеток заполняют счетную камеру Горяева, как описано выше. Заполненную камеру оставляют на 1 мин для оседания лейкоцитов, после этого устанавливают ее на столик микроскопа и при малом увеличении подсчитывают лейкоциты в 100 больших квадратах сетки Го-ряева, не разделенных на малые квадраты и полосы. Так же как и при подсчете эритроцитов, считают клетки, расположенные внутри квадрата и на его левой и верхней границах.

Расчет общего количества лейкоцитов проводят по формуле:

Х= ах 20/100 х Ь,

где Х– число лейкоцитов в 1 мкл крови;

а– число посчитанных лейкоцитов;

Ь– объем одного большого квадрата (4,0 х 10 ^{– 3}мкл);

20 – разведение крови;

100 – число больших квадратов, в которых производился счет.

Введя в эту формулу значения объема одного большого квадрата, получим:

X= ах 20/100 х (4 х 10 ^{– 3}) = ах 20/400 х 10 ^{– 3}= ах 50/мкл.

Таким образом, количество лейкоцитов в 1 мкл равно числу клеток, посчитанных в 100 больших квадратах, умноженному на

50:

X= ах 50.

Пример: в 100 больших квадратах сосчитано 130 лейкоцитов. Тогда количество лейкоцитов в 1 мкл составит (130 х 50) = 6500, или 6,5 х 10 ³/мкл. Учитывая, что в 1 мкл крови содержится 10 ⁶мкл, число посчитанных лейкоцитов можно выразить следующим образом: 6,5 х 10 ⁹/л.

Поскольку подсчет количества форменных элементов в камере Горяева представляет собой весьма трудоемкое исследование, в клинической практике все чаще используют специальные автоматические счетчики клеток крови и гематологические автоматы, работа которых основана на разных принципах.

По механизму работы они все делятся на две большие группы: кондуктометрические, оптические с использованием в качестве источников света лазеров (проточные цитометры).

В основе работы кондуктометрических анализаторов

лежит изменение электрического сопротивления. Определенное количество разведенной изотоническим раствором натрия хлорида или другим электролитом крови пропускают через микроотверстие. Проходящая клетка увеличивает сопротивление между электродами, возникающий импульс передается на счетное устройство с цифровой индикацией. Данная методика была предложена братьями Культер в 1947 г.

Однако если в один момент в канале находятся две клетки, то будет зарегистрирован только один импульс, что приведет к ошибке подсчета клеток. Во избежание таких ошибок, нужно развести пробу крови до такой концентрации клеток, при которой в канале датчика всегда будет не больше одной клетки.

Чтобы определить необходимую степень разведения цельной крови, нужно знать объем измерительного канала (V канала). Если в объеме измерительного канала в среднем находится одна клетка, то концентрация равна канала. Однако при этом вероятность того, что в канале могут находиться две и более клеток, достаточно велика. По законам математической статистики вероятность одновременного прохождения двух клеток через канал ничтожно мала, если концентрация клеток в 10 раз меньше, чем канала. При диаметре канала 80 мкм и длине 100 мкм получаем объем 0,5 мм ³. Чтобы уменьшить концентрацию клеток цельной крови (5 000/мм ³) до нужной величины, необходимо выполнить разведение в 5 000 х 0,5 х 10 = 25 000 раз.

Раздельное определение эритроцитов и тромбоцитов в современных анализаторах решается просто: тромбоциты (небольшие по размеру клетки) при прохождении измерительного канала генерируют электрические импульсы низкой амплитуды, а клетки большего размера – эритроциты – импульсы высокой амплитуды. Устройство, которое разделяет импульсы по величине амплитуды, – дискриминатор. В современных анализаторах применяются многоканальные дискриминаторы, позволяющие получить детальную информацию о размерах клеток в виде гистограмм, поскольку каждый канал соответствует определенному объему клеток. Выделив на гистограмме зону объемов клеток, соответствующих эритроцитам, и просуммировав данные, полученные по всем каналам, можно получить общее количество прошедших через датчик эритроцитов. Если при суммировании результатов подсчета эритроцитов значение каждого канала умножать на величину объема соответствующего канала, то получится величина суммарного объема, который занимают эритроциты – гематокрит. При делении гематокрита на концентрацию эритроцитов можно получить еще одну характеристику эритроцитов – средний объем.

Аналогичные показатели можно получить и для тромбоцитов: концентрацию тромбоцитов, тромбокрит, средний объем тромбоцитов.

Поскольку размеры лейкоцитов близки к размерам эритроцитов, их не удается разделить вышеописанным методом. При использовании кондуктометрических счетчиков в подсчет эритроцитов неизбежно будут вносить вклад лейкоциты. Однако за исключением явных лейкоцитозов их вклад будет ничтожно мал, так как в норме концентрация эритроцитов в крови на 3 порядка превышает концентрацию лейкоцитов. В то же время при определении концентрации лейкоцитов необходимость разрушения эритроцитов очевидна. Эта задача оказалась легко решаемой, так как свойства мембран эритроцитов и лейкоцитов существенно различаются. В частности, эритроциты легко лизируются под воздействием многих поверхностно-активных веществ, при этом лейкоциты, хотя и претерпевают некоторые изменения, но остаются целыми. Таким образом, при подсчете лейкоцитов, прежде чем пропустить разведенную суспензию крови через апертуру датчика, к ней добавляют раствор поверхностно-активного соединения (лизирующий раствор или гемолитик). Под действием гемолити-ка эритроциты разрушаются до очень мелких осколков, которые при подсчете лейкоцитов генерируют электрические импульсы очень низкой амплитуды, не влияющие на результат анализа.

Для гематологических анализаторов с дифференциацией лейкоцитарной тройки используется специальная композиция растворителя и гемолитика, в которой различные формы лейкоцитов претерпевают изменения размеров в разной степени и благодаря этому могут разделяться кондуктометрическим методом. Область малых объемов формируется лимфоцитами, которые под действием гемолитика значительно уменьшаются в объеме. Грануло-циты, напротив, расположены в области больших объемов. Между двумя пиками расположена зона так называемых «средних лейкоцитов», в которую попадают моноциты, базофилы, эозино-филы и плазматические клетки (см. рис. 7).