Полный справочник медицинской аппаратуры
Шрифт:
Все современные гематологические автоанализаторы измеряют и концентрацию гемоглобина, для чего у них имеется встроенный гемоглобинометр. При этом измерение концентрации гемоглобина происходит параллельно с определением концентрации лейкоцитов.
Оптические гематологические анализаторы в своей работе используют эффекты светорассеяния и флуоресценции, часто такие устройства называют проточными цитометрами. Измерение светорассеяния на клетках крови в проточных цитометрах производится в определенные телесные углы: 5°, 10°, 90°.
Физические свойства клеток (размер или цитоплазматическая гранулярность) могут быть измерены на любой отдельной неокрашенной клетке. Клетки также могут быть помечены специфическими красителями, окрашивающими ДНК, РНК или белок, или целым набором флюорохром-конъюгированных антител, направленных к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток.
Метод проточной цитометрии позволяет существенно увеличить объем информации, снимаемой с анализируемой частицы по светорассеянию. Только с использованием этой методики можно измерить индикатрису светорассеяния индивидуальной частицы. Индикатриса светорассеяния – это зависимость интенсивности рассеянного света от угла рассеяния. Причем диапазон измеряемых углов в проточных цитометрах составляет 5-120°. Технология проточной цитометрии включает в себя не только измерения индикатрисы светорассеяния, но и методы решения обратной задачи светорассеяния, т. е. методы, позволяющие получать информацию о морфологии клетки из индикатрисы светорассеяния. Таким образом, измерение и обработка индикатрис светорассеяния от клеток позволяют не только дифференцировать клетки крови, но и характеризовать эти клетки: определять их размер, форму, структуру, состав и т. д.
Технология проточной цитометрии имеет ряд преимуществ перед описанными выше методиками.
1. Если изображение в микроскопе является двумерной проекцией клетки, то индикатриса светорассеяния является своего рода одномерным отображением клетки и содержит не меньше информации о характеристиках клетки. В случае каких-либо патологических явлений в клетке можно создавать банк данных индикатрис светорассеяния патологических клеток, точно так же как это уже сделано для микроскопных изображений, и не прибегая к микроскопу в реальном времени производить анализ.
2. Благодаря развиваемым подходам в решении обратной задачи светорассеяния контроль качества работы прибора может осуществляться ежедневным измерением калибровочных сфер определенного размера, а не по крови здорового донора и контрольных измерений калибровочной крови.
3. Использование большого количества информации, содержащейся в индикатрисе светорассеяния, повышает способность проточных цитометров к дифференцировке
4. Кинетические измерения индикатрис светорассеяния клеток в процессе реагирования на какое-либо воздействие в сочетании с развиваемой кинетической моделью данного процесса позволяют определять многие дополнительные характеристики клеток. Так, при измерении процесса лизиса и сферизации эритроцитов можно измерить их дополнительные характеристики, такие как площадь, проницаемость и жесткость мембраны.
В настоящее время все проточные цитометры по производительности можно разделить на две группы:
1) простые в использовании и обслуживании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10° (малоугольное прямое рассеяние) и 90°;
2) большие клеточные анализаторы, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с заданным набором этих параметров.
Сегодня проточная цитометрия – ведущий метод в клинической иммунологии. В клинической гематологии он может быть использован для решения следующих задач:
1) иммунофенотипирования лимфоцитов, включая определение количества СD4, СD8 клеток и даже ТН1 и ТН2 (по продукции специфических цитокинов);
2) анализа процессов клеточной активации на основе определения маркеров ранней активации: СБ25 (рецептор интерлейки-на-2), СD38, СD69, СD71 (трансферриновый рецептор), СD95 (антиген апоптоза), СD122, анти-HLA-DR;
3) определения маркеров пролиферативной активности клеток иммунной системы (Ki-67, PCNA, Cyclin D3);
4) оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями;
5) иммунофенотипирования острых лейкозов и лимфом;
6) анализа клеточного цикла с определением распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия);
7) детекции и наблюдения минимальной резидуальной болезни (МRD);
8) анализа маркеров апоптоза (аннексина V, CD95 Fas/APO-1, CD95L, Bcl-2, P53).
В качестве примера устройств, использующих в своей работе методику проточной цитометрии, может послужить проточный цитометр EPICS 4 XL фирмы Beckman Coulter (США).
Проточный цитометр EPICS 4 XL
Общие характеристики
Проточный цитометр EPICS 4 XL – позволяет работать с четырехцветной меткой, т. е. определять в одной пробе сразу 4 параметра с использованием одного источника света – аргонового лазера. Это существенно удешевляет конфигурацию прибора и облегчает задачу оператора. Устраняется необходимость введения временной задержки, устанавливаемой при проведении четырехцветного анализа на приборе с двумя лазерами.
Скорость анализа составляет до 10 000 клеток в секунду, что позволяет получить статистически достоверную информацию о морфологии клеток, их поверхностных антигенах, внутриклеточных ферментах, содержании ДНК и т. д.
Производительность прибора – 90 образцов в ч. Станции Q-Prep и DNA-Prep позволяют автоматизировать пробоподготов-ку для иммунофенотипирования лейкоцитов и ДНК-анализа. Автоматическое устройство Q-Prep проводит приготовление суспензии клеток для анализа за 35 с. Использование безотмывочной технологии лизиса эритроцитов цельной крови позволяет осуществлять подсчет абсолютного количества клеток с помощью референсных частиц.